Método de marcación genética de plásmidos de Escherichia coli.

Abstract

Escherichia coli forma parte de la microbiota intestinal de los animales de sangre caliente, y es el principal anaerobio facultativo que reside en el colon humano. Esta especie ha evolucionado hacia distintos patotipos (ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, ExPEC, EAEC) que involucran la adquisición de islas de patogenicidad que pueden ser transportadas por plásmidos mediante transferencia horizontal. La posibilidad de evolución constante de los patotipos de E. coli explicaría en gran medida la enorme diversidad de clones de E. coli enterotoxigénica (ETEC) en regiones geográficas definidas. En el presente proyecto se desarrolló un método para marcar por medio de conjugación, plásmidos de ETEC con el transposón Tn5. Para ello se seleccionó mutantes de E. coli resistentes al ácido nalidíxico y ciprofloxacina, que sirvieron como marcadores en la selección de los transconjugados. A continuación, por medio de conjugación, se creó una biblioteca de mutantes de ETEC utilizando el transposón Tn5. La primera conjugación se realizó entre: Escherichia coli HB101 resistente a kanamicina (transposón Tn5) con ETEC (gen de patogenicidad LT) resistente al ácido nalidíxico. Para la segunda conjugación, se partió del Conjugado #1 (ETEC resistente al ácido nalidíxico + Tn5) y se lo conjugó con E. coli K12 resistente a ciprofloxacina. Finalmente se llevó a cabo la confirmación molecular, mediante amplificación por PCR tanto del gen LT, como del gen de resistencia a la kanamicina (KM). Mediante conjugación se logró marcar un plásmido de ETEC desconocido con el transposón Tn5. Sin embargo dicho plásmido no contiene el gen de patogenicidad (LT), por lo cual no se logró identificar a mutantes de ETEC con la capacidad de transferir horizontalmente al Tn5. La transferencia del Tn5 a distintas cepas de Escherichia coli (ETEC, K12) se confirmó mediante la amplificación por PCR del gen de resistencia a la kanamicina. La presente investigación buscó determinar si existe transferencia horizontal de plásmidos de patogenicidad de ETEC a otros linajes de E. coli.